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DIAGNÓSTICO DO HPV PELAS METODOLOGIAS DE PCR, PCR rt, PESQUISA DE PROTOONCOGÊNES, CAPTURA HÍBRIDA (CH) E CITOLOGIA.

São conhecidos mais de 100 tipos de papilomavírus humano (HPV), dos quais 30 têm sido reportados em infecções ano genitais. A infecção tem importância clínica, pois alguns tipos virais estão associados a lesões que podem progredir para o câncer cervical. Sabe-se que os métodos moleculares são muito importantes para o diagnóstico dessa infecção. (3) A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é extremamente comum e está associada a várias condições clínicas, que variam de infecções assintomáticas a doenças benignas e malignas da mucosa genital, como as verrugas genitais, a neoplasia intraepitelial cervical e o câncer do colo do útero. (4) Atualmente, já está bem estabelecido o papel do papilomavirus humano (HPV) como o fator promotor da neoplasia cervical. A relação entre o HPV e a carcinogênese está associada com o tipo viral, se de alto ou baixo risco oncogênico, a carga viral e sua persistência e a integração no genoma da célula hospedeira. A infecção pelo HPV é a doença sexualmente transmissível mais frequente na população geral, com uma prevalência de 20 a 40% entre as mulheres jovens. Verifica-se, porém, que entre as mulheres infectadas pelo HPV de alto risco oncogênico, apenas 10% a 20% desenvolvem NIC 2 ou 3 e menos de 1% câncer invasor. (6) Embora o carcinoma invasor do colo do útero seja um tipo de câncer evitável, no Brasil é um importante problema de saúde pública, com mortalidade estacionária na maior parte do país e decrescente em apenas alguns municípios, nos últimos anos (Mirra et al., 2001; Morais, 1997). O principal objetivo dos programas de controle do câncer cérvico uterino é reduzir a mortalidade e morbidade por meio de detecção das lesões precursoras. A colpo citologia oncológica (CO) é o método mais difundido mundialmente para esse rastreamento. Desde a sua introdução por Papanicolau & Traut (1941), uma redução nas taxas de incidência e mortalidade por câncer de colo uterino próxima de 70% foi observada (6). 

METODOLOGIAS PARA O RASTREAMENTO DOS DIFERENTES TIPOS DE HPV. 

A descoberta da associação entre o câncer e o papilomavírus humano (HPV) levou a avanços tecnológicos importantes, incluindo o desenvolvimento de testes moleculares. As técnicas de biologia molecular identificam a presença do vírus mesmo em pacientes assintomáticos (5). Nos dias de hoje são conhecidos mais de 100 tipos diferentes do papilomavírus humano (HPV), sendo que aproximadamente 30 possuem tropismo pelo epitélio escamoso do trato genital inferior. Os tipos virais 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e CP6108 são considerados de baixo risco para o desenvolvimento de câncer cervical, sendo relacionados com lesões benignas (verrugas planas ou elevadas e neoplasia intraepitelial cervical [NIC]). Os tipos de médio e alto riscos incluem: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82, e são relacionados a lesões de alto grau (NICs II e III) e câncer. Entre estes, os tipos 16 e 18 parecem possuir um potencial carcinogênico maior em relação aos demais vírus. Atualmente, os tipos 26, 53 e 66 também são considerados de alto risco em potencial. Além disso, muitas vezes podem ocorrer infecções por múltiplos tipos de HPV (3). O câncer do colo uterino é o segundo câncer mais frequente em mulheres no mundo, refletindo a prevalência dos fatores de risco e a falta ou insuficiência de programas de prevenção. O câncer invasor é precedido por lesões precursoras, as neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC), classificadas em três graus relacionados com a magnitude da desestruturação da arquitetura e discariose, denominadas respectivamente de NIC 1, NIC 2 ou NIC 3. (2) A NIC, principalmente a NIC 1, pode regredir ou permanecer estacionária por muitos anos com taxa muito baixa de evolução para câncer invasor. A NIC 2 ou 3, entretanto, apresentam uma taxa maior de progressão e precisam ser tratadas. A escolha do método terapêutico depende de vários fatores, como a gravidade e a extensão da lesão, a idade e o desejo reprodutivo da mulher e a disponibilidade tecnológica do serviço. Os métodos mais eficazes e seguros no tratamento da NIC são os de excisão, que permitem a avaliação histológica do espécime cirúrgico e minimizam o risco de não se diagnosticar uma neoplasia invasora. A conização clássica a frio, a laser ou por cirurgia diatérmica com alça é hoje a terapêutica mais utilizada (1). A infecção persistente por tipos oncogênicos do HPV tem sido descrita como principal fator causal para o desenvolvimento do câncer do colo uterino e de suas lesões precursoras. Esse tipo de câncer representa a segunda causa mais comum de câncer em mulheres no mundo, com cerca de 471 mil novos casos com 233 mil mortes reportadas a cada ano, constituindo-se em um dos mais graves problemas de saúde pública, especialmente para os países em desenvolvimento como o Brasil (cerca de 40 mil novos casos por ano) (3). A prevalência do HPV na população é alta. As estimativas globais indicam que aproximadamente 20% dos indivíduos estão infectados por algum tipo de HPV (10, 13). A expectativa é que 75% a 80% da população será infectada durante sua vida. Um aumento nesses números tem sido observado desde 1960, como consequência da prática do uso de contraceptivos orais, diminuição do uso de outros métodos de barreira, início precoce das relações sexuais, aumento do número de parceiros sexuais, paridade elevada e baixo nível socioeconômico. Além disso, avanços tecnológicos nos métodos diagnósticos nos permitiram também detectar maior número de pacientes infectados e, consequentemente, em risco para o desenvolvimento de neoplasias (3). O diagnóstico das alterações promovidas pela infecção por HPV pode ser clínico, citopatológico, colposcópico e histopatológico, porém o diagnóstico da infecção viral é, na maioria das vezes, realizado por técnicas moleculares. Além da identificação da presença do vírus, permite a identificação do tipo viral infectante, o que não é possível com as outras ferramentas diagnósticas. São descritas três formas de apresentação da infecção: latente, subclínica e clínica, ligadas ao tipo viral infectante. Na forma clínica há presença de lesões vegetantes e exofíticas, visíveis a olho nu, sem técnica de magnificação. Na subclínica o diagnóstico se inicia com a inspeção do colo, exame citopatológico e colposcópico, com magnificação após aplicação de ácido acético ou solução de Schiller. A localização das alterações permite direcionar para a biópsia. A forma latente caracteriza pela normalidade tecidual à colposcopia, não havendo alterações cito e histológicas, identificada por meio de técnicas de biologia molecular(5). O diagnóstico molecular da infecção pelo HPV é importante para a triagem do vírus e baseia-se, principalmente, em métodos como: captura híbrida (CH), southern blot, hibridização in situ, hibridização em fase sólida (microarrays) e reação em cadeia da polimerase (PCR). Entre eles, a captura híbrida 2 (CH2) é o método molecular mais utilizado em nosso meio para a detecção de HPV. Esta técnica baseia-se na hibridização de DNA, fazendo uso de sondas específicas contra os tipos de HPV considerados de alto risco. A PCR baseia-se na amplificação específica de segmentos do DNA alvo e tem potencial para a detecção de níveis muito baixos de carga viral em células e tecidos, mesmo em infecções ditas não produtivas. A PCR em tempo real (PCR-TR), por sua vez é uma variação do método de PCR convencional (PCRc). Esta metodologia permite distinguir as sequências de bases amplificadas de DNA por análise da temperatura de separação das duplas fitas, e, como as reações ocorrem em ambiente fechado, diminui a ocorrência de contaminações. Além disso, o uso de primers universais permite, teoricamente, a detecção de todos os tipos de HPV existentes (3). Os métodos de escolha para o estudo, PCRc, PCR-TR e CH2, são utilizados de forma isolada para a triagem do HPV e para avaliar a eficácia da vacina contra o vírus, não sendo métodos complementares para o diagnóstico da infecção. A CH2 apenas detecta os HPVs de alto risco, mas não pode determinar o tipo viral específico. Além disso, não detecta todos os tipos virais de alto risco e a sensibilidade do método (cerca de 5.000 cópias/ml) pode não ser adequada para revelar a presença do vírus no início da infecção. As técnicas que utilizam PCR são, em geral, mais sensíveis, e podem ser combinadas com a detecção por sondas específicas (linear array ou análise de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição [RFLP]) para determinar os vários tipos virais (3). Quando comparados ao método de CH2, são mais complexos e mais caros, entretanto possuem a vantagem de conseguir identificar vários tipos de HPV e não apenas separá-los em grupos, oncogênico e n/ão oncogênico, além de quantificar a carga viral com maior exatidão e reprodutibilidade . Além da identificação da infecção e dos tipos específicos infectantes (tipagem), as técnicas de PCR permitem identificação da ocorrência do fenômeno de integração e possibilitam avaliar a expressão das oncoproteínas (5).